Cómo hacer diluciones de anticuerpos para IHC

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica especialista usado por los científicos para visualizar las células dentro de los tejidos que han sido colocadas en un portaobjetos y se tiñeron con un anticuerpo apropiado que reconoce una proteína que es único para la célula o tejido bajo investigación. Diluciones de anticuerpos (titulaciones), deben realizarse mediante las condiciones experimentales especificadas en el protocolo propio del usuario, no la del fabricante del anticuerpo, ya que los dos no pueden ser iguales. Cosas que necesitará
células para teñir
Antibody
tampón de dilución ("diluyente")
pipetas y puntas
Microfuge tubo
Papel de aluminio
marcadores de laboratorio y etiquetas tubo
Ice
protegido de la luz diapositiva cuadro
Ver Más instrucciones
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verificar y preparar el anticuerpo. Verifique que el anticuerpo se ha planteado en el host correcto, y reacciona con la versión exacta de la proteína (conocida como la isoforma o variante de empalme) que se está probando. Con una pipeta, tomar cuidadosamente una porción de 10 microlitros de esta y la etiqueta como "acciones personales".

Si sólo muy pequeñas cantidades de anticuerpos están disponibles, omita este paso.

Mantener un stock de personal de anticuerpo es una práctica rutinaria en todos los laboratorios, ya que evita la contaminación cruzada de la población original. Dispense esta en un tubo de microcentrífuga protegido de la luz, o un tubo de microcentrífuga normal, que se envuelve en papel de aluminio para protegerlo de la luz directa.

Mantenga este tubo en hielo, preferiblemente en una Esky con una tapa hermética, nuevamente para minimizar la luz, que puede destruir el anticuerpo. Hacer una nota de la concentración de la población original (por ejemplo, 100 unidades por mililitro, 1 miligramo por microlitro y así sucesivamente) en el tubo, incluyendo el nombre del anticuerpo y lo que, en su caso, el tampón se diluye en (por ejemplo, suero, solución salina, o agua, etc).
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Preparar el tampón de dilución, también conocido como el diluyente de anticuerpo. Asegúrese de que esto es compatible con el anticuerpo y el procedimiento de inmunohistoquímica se utiliza, por ejemplo, no debe ocultar ninguna fluorescencia o inhibir a la rotulación posterior anticuerpo secundario. Hacer una dilución estándar de inmunohistoquímica (también el amortiguador de bloqueo) mediante la mezcla de fosfato 1X solución salina tamponada con 1% Tritón-X100, 10% de suero fetal bovino y 0,2% de azida sódica.
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Valorar la anticuerpo. Con la concentración dada de anticuerpos en la acción personal (expresada en unidades de concentración como microgramos por microlitro), determinar el volumen de anticuerpos necesario para obtener 10 microgramos de anticuerpo.

Establecer una serie de diluciones con la pipeta un volumen equivalente a 2 microgramos de anticuerpo (por ejemplo, X microlitros), en 100 microlitros de diluyente y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. De esta dilución de partida, tomar las mismas microlitros X y añade que, para un posterior 100 microlitros de diluyente. Repita este procedimiento hasta 8-10 diluciones (o una serie) se compone.

Por consiguiente, el último tubo se tiene la concentración más baja sea la concentración y "saturación" que va a generar el más alto nivel de la señal durante el experimento . Sin embargo, la concentración ideal será ligeramente más concentrado que este, de modo que no se produce demasiada señal, que puede causar errores de fondo.

Etiqueta de los tubos correctamente con las nuevas concentraciones diluidas.