Criopreservación Procedimientos
general
procedimientos de criopreservación
son los que permiten que las células que se almacenan de forma indefinida mediante el uso de temperaturas extremadamente frías a suspender las actividades metabólicas. Hay dos tipos principales de procedimientos de criopreservación: equilibrio (congelación lenta convencional) y no-equilibrio o ultra-congelación rápida (vitrificación). El término vitrificación viene del latín "vítreo" o vítreo. Ambos procedimientos utilizan crioprotectores con propiedades de tipo anticongelante para prevenir el daño celular durante el proceso de congelación. Una vez que las células se congelan o vitrificados, pueden ser almacenados indefinidamente por inmersión en nitrógeno líquido, un líquido extremadamente frío con una temperatura de -196 C (-321 F). Para restaurar la actividad metabólica en la célula después de la descongelación, crioprotectores tóxicos deben ser retirados de la célula y el equilibrio normal de agua gradualmente restaurada como la celda se devuelve a una temperatura normal de funcionamiento.
Célula- Factores específicos
El procedimiento utilizado para criopreservar las células o el tejido depende de un número de factores que incluyen el tamaño de la célula, la cantidad de fluido celular (citoplasma) y la complejidad de la célula (célula única o tejido). Las células con una gran cantidad de citoplasma, tales como los huevos son más difíciles de criopreservar que las células con sólo residual de citoplasma, como las células de esperma. La criopreservación de tejido ovárico es más difícil porque por lo menos tres tipos diferentes de células de diferentes tamaños están presentes en el tejido de ovario, cada uno con diferentes necesidades de congelación óptimas. Protocolos de congelación lenta se han utilizado con éxito con varios tipos de células. Vitrificación actualmente es más efectivo con la congelación de células individuales y menos eficaz con los tejidos, pero la investigación está en curso para optimizar la vitrificación de los tejidos.
Papel de crioprotectores
El citoplasma de una célula contiene agua, que se convierte en cristales de hielo a temperatura de congelación. Cuando se forme hielo en el interior de una célula, la célula se tritura y se muere. Por lo tanto, el fluido en la celda debe ser eliminado antes de alcanzar temperaturas de congelación para evitar el daño celular. Varios tipos de fluidos anticongelantes (crioprotector) se pueden utilizar para deshidratar la célula antes de la congelación, incluyendo glicerol, propanodiol, dimetil sulfoxde (DMSO), etanol y azúcares como la sacarosa y la trehalosa. La tasa óptima de enfriamiento (y descongelación) depende del tipo de crioprotector utilizado y de la característica de la célula o tejido a ser (o que era) congelado. Los crioprotectores son tóxicos para las células para metabolizar la exposición de células a crioprotectores a temperaturas más cálidas metabólicas deben minimizarse o evitarse. Al descongelar o calentar las células, crioprotectores deben retirarse completamente de la célula antes de que se restablezca la actividad metabólica.
Equilibrium Versus no equilibrio Criopreservación Procedimiento
La velocidad de congelación depende de si el protocolo de congelación de equilibrio es-o no-equilbrium basada. Para los procedimientos de tipo de equilibrio, la velocidad de congelación óptima se logra cuando hay un equilibrio entre la velocidad a la que la célula está siendo deshidratado de agua y la velocidad a la cual el agua fuera de la célula está siendo transformado a la fase de hielo. Estos protocolos de equilibrio o de lento congelación suelen tardar horas en completarse y un ordenador se utiliza para ejecutar un congelador de velocidad programable para garantizar que las tasas de congelación son exactamente como se requiere. Normalmente hay un paso "hold" en el protocolo cerca de la salida para permitir la creación manual de los cristales de hielo de arranque o "siembra" en el líquido fuera de las células.
Vitrificación, un enfoque totalmente diferente al se utiliza congelación que no se basa en las rampas y el logro de un equilibrio entre la deshidratación y la formación de cristales de hielo. La vitrificación es tan ultra-rápido que no hay tiempo suficiente para la formación de hielo y el líquido celular se convierte directamente en una fase vítrea o de vidrio, sin daños a la célula. Congeladores tasa programables no son necesarios porque la célula se sumerge directamente en nitrógeno líquido muy frío, el logro de un estado vítreo instantánea.
Lenta-Freeze Procedimiento
El primer paso de el procedimiento de congelación lenta-es exponer la célula a crioprotector en una manera escalonada gradual para permitir lentamente equilibración de la célula con el crioprotector mientras que la liberación de agua. Una vez que las células se han limpiado de la mayor parte del agua celular, las células en el líquido crioprotector se colocan en un recipiente de algún tipo, tal como una pajita de plástico, una ampolla de vidrio o plástico vial.The un volumen de líquido que rodea las células para congelación lenta es típicamente menos de una cucharadita y sólo puede ser unas pocas gotas. El recipiente de pre-marcado se llena, sella y se puso en un congelador programable, lo que disminuye lentamente la temperatura del recipiente durante un periodo de minutos o de horas a temperaturas muy bajas. Después de unos minutos de enfriamiento, los cristales de hielo de arranque deben ser formados en el interior del recipiente por "siembra" el recipiente. La siembra se lleva a cabo mediante el uso de una herramienta (por ejemplo, fórceps) que han sido pre-enfriado en nitrógeno líquido a tocar el contenedor y causar la formación de cristales de hielo. Este cristal arranque iniciará formación controlada de cristales de hielo en un solo lugar, a salvo de las células. Una vez que la siembra se ha completado, el resto de las rampas de enfriamiento puede proceder. Cuando el contenedor llega a temperaturas entre -30 y -85 C, el recipiente que contiene las células puede ser sumergida directamente en nitrógeno líquido para completar el enfriamiento a -196 C.
vitrificación
Ultra-rápido de no equilibrio refrigeración procedimientos como la vitrificación usar mayores concentraciones de crioprotectores, junto con una tasa de congelación casi instantáneo alcanzado por el desplome de las células directamente en nitrógeno líquido. La vitrificación evita la fase de formación de cristales de hielo y se mueve el agua directamente a una fase similar al vidrio. Vitrificación logra el mismo punto final como la congelación lenta, pero a una tasa de -3000C/min, en comparación con 10C/min o más. Para la vitrificación, las células se colocan generalmente en la punta de una paja y el exceso de crioprotector es eliminado, dejando sólo lo suficiente para que la célula se adhiere al recipiente por la tensión superficial, antes de sumergirse en nitrógeno líquido. Debido a la congelación es tan rápido, la duración de la exposición a los crioprotectores es mucho menos, y concentraciones mucho más altas de crioprotectores puede ser tolerada por la célula. El calentamiento de la célula para volver a funcionamiento metabólico normal también debe ser muy rápida. Manipulación de las muestras vitrificados es mucho más exigente que las muestras lento-congelados ya que incluso una breve exposición a una temperatura superior a la del nitrógeno líquido puede iniciar un proceso de calentamiento no planificada y recongelación, que es perjudicial para la célula.