protocolos de clonación molecular abarcan los procedimientos utilizados para definir , aislar y replicar una secuencia de ADN . Protocolos de clonación de restricción y ligación tradicionales inician la fragmentación del ADN con endonucleasas de restringidas (enzimas que cortan las cadenas de ADN en sitios de restricción ) , la ligadura de fragmento de ADN ( la reparación de discontinuidades en moléculas de ADN ) , la transfección ( la introducción de ácido nucleico en un cuerpo de la célula ) y la selección ( la elección de genomas individuales para la replicación ) . Aislamiento

Los protocolos para el aislamiento de un fragmento de ADN , el primer paso en la clonación molecular , a menudo incorporar una reacción en cadena de la polimerasa ( PMR ) , que utiliza ciclos de calentamiento y enfriamiento para amplificar fragmentos de ADN . Para alcanzar el tamaño de la secuencia objetivo , otros protocolos incluyen sonicación ADN , reacción de la enzima de digestión y el uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente . Estos protocolos pueden variar dependiendo de la magnitud y la cantidad de ADN aislado es necesario.

Ligadura

Protocolos para la ligadura involucran el uso de una enzima, la ADN ligasa, para unirse a las moléculas de ADN , junto con un enlace covalente . Protocolo dicta la combinación de fragmentos de ADN , el vector de clonación , un tampón de ligación , la ligasa de ADN y agua esterilizada en un tubo de microcentrífuga y se incubó durante la noche a 4 grados Celsius .
Transfección

Protocolos

para la transfección , o la infusión de ADN en una célula usando un medio no - virales , a menudo implican la inyección de ADN directamente en el citoplasma de la célula . Otros métodos incluyen el uso de reactivos químicos , tales como fosfato de calcio y lípidos, para entregar el complejo de transfección a través de la membrana celular . Este método pone a prueba los efectos de la modificación genética en el funcionamiento de los genes específicos.
Selección

selección o cribado, protocolos determinan que las células llevan a cabo con éxito la inserción de ADN e indican que las células necesitan aislamiento . Una centrífuga células cosechas que contienen el ADN transfectado , que luego se incubó en una lisozima ( una enzima de origen natural ) de amortiguación y se trataron con un detergente alcalino , dando las proteínas y las membranas de solubilidad . Uso de etilo para precipitar las proteínas , una centrífuga y estopilla Filtrar el sobrenadante que contiene ADN ( el líquido soluble restante a partir de un compuesto se centrifugó ) . El sobrenadante se precipitó con polietilenglicol , se centrifugó , y se suspendió en un tampón de cloruro de cesio y bromuro de etidio . El bromuro de etidio tiñe el ADN de acuerdo con la densidad, y el uso de una luz ultravioleta de onda larga , el ADN - banda inferior se extrae con una jeringa de cinco cc . Una columna de intercambio iónico equilibrada separa el ADN a partir del bromuro de etidio y cloruro de cesio , y el sedimento de ADN final se resuspende en una solución tampón y se detecta en la electroforesis en gel de agarosa .