electroforesis en gel de poliacrilamida , o PAGE , es una técnica comúnmente utilizada para la separación de moléculas orgánicas en una muestra biológica . Las moléculas con tamaño y menor peso migran más rápido en un gel de poliacrilamida cuando se aplica una corriente eléctrica . Distintas bandas claras se observan generalmente después de que el gel de completado se incuba en una mancha en particular. Se trata de un método relativamente simple . Sin embargo , la ausencia de franjas o bandas que se corran o no son limpios podría indicar un problema en una o más etapas del procedimiento . Debe seguir las normas básicas para solucionar problemas de un método de electroforesis en gel cuando sus resultados no son los esperados . Cosas que necesitará
bis grado de calidad: acrilamida o placas prefabricadas
Dos placas de vidrio
acrilamida : bis
TBE buffer ( Tris , ácido bórico , EDTA )
Alimentación
superior cámara tampón
Baja cámara tampón
Proteína de muestra de ADN persulfato
TEMED
amonio Gel mancha
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Una Comience con el paso final de la electroforesis en gel de primera y trabajar hacia atrás . Para la electroforesis en gel , el paso final es el procedimiento de tinción utilizado para observar bandas de muestra . Pocos problemas debe ocurrir realmente durante el procedimiento de tinción. Sin embargo , las manchas en polvo deben estar bien disolverse en el tampón apropiado antes de que se utilizan para teñir un gel . Averiguar se utilizó la concentración correcta de mancha.
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Compruebe la fuente de alimentación. La ausencia de bandas podría indicar el ajuste de corriente o tensión era demasiado alto y las muestras de prueba migró el gel . Los valores altos pueden causar también componentes de la muestra que migran a través del gel demasiado rápido , causando una pobre resolución y bandas que aparecen inmundo . Las muestras pueden no migran a través del gel si el ajuste de la fuente de alimentación es baja. Las muestras también pueden derivar del pozo en el que se cargaron y no migran a través del gel .
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Compruebe la acrilamida líquido utilizado para emitir el gel de poliacrilamida. Por lo general , el porcentaje de acrilamida utiliza para convertir a está comprendido en gel de poliacrilamida del 5 al 15 por ciento. Las muestras compuestas de moléculas más grandes se carga en un gel de 5 por ciento debido a grandes fragmentos se mueven más lentamente en geles de acrilamida con un porcentaje más alto. Las moléculas pequeñas se carga en un gel de ciento mayor debido a una baja concentración de gel no sería capaz de resolver muestras más pequeñas .
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Compruebe los reactivos utilizados para polimerizar la acrilamida . Un gel de poliacrilamida se forma por polimerización de una mezcla líquida que consiste de bisacrilamida y acrilamida . Persulfato de amonio y TEMED se añaden a la acrilamida para catalizar la formación de gel . Típicamente , la acrilamida debe mostrar signos de polimerización ( formación de gel ) 15 minutos después de que se han añadido persulfato de amonio y TEMED . La polimerización que se produce demasiado rápido es el resultado de altas cantidades de persulfato de amonio . Demasiado poco persulfato de amonio puede causar polimerización incompleta o desigual.
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Confirme la cantidad de las muestras cargadas . Las altas concentraciones de las muestras pueden moverse lentamente a través del gel y reducir la resolución banda. Una concentración de la muestra que es baja no podrá efectuarse después de que el gel se ha manchado . Estas manchas tienen limitaciones en cuanto a la cantidad mínima de muestra que se puede asociar como resultado de la sensibilidad mancha.
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Calidad confirmar las muestras cargadas . Las sales y otros contaminantes presentes en una muestra pueden afectar el movimiento de la muestra a lo largo del gel. La electroforesis es el resultado de la corriente eléctrica corriendo a través de un gel que contiene un tampón conductor de la corriente ; altas concentraciones de sal en la muestra pueden afectar a la circulación de esta corriente a través del gel . Su aislamiento de una muestra debe incorporar un kit de purificación que produzca una muestra relativamente pura .
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revisión de la literatura o del protocolo escrito para determinar si se ha utilizado la PÁGINA adecuada para llevar a cabo el experimento. El porcentaje de acrilamida en PÁGINA es específico para el tamaño de la muestra a ensayar . La literatura también podría proporcionar información específica con respecto a la puesta en marcha de la fuente de alimentación y la velocidad de migración de la muestra.