La ligadura es un método utilizado en la investigación biológica para unir hebras separadas de ADN. El proceso se ha simplificado utilizando kits de ligamiento disponibles en el mercado . Un procedimiento de ligadura generalmente es seguido por la transformación , un proceso de insertar el ADN unido en un destinatario vector bacteriano , para clonar y amplificar el ADN . Debido a la complejidad del método , los resultados a menudo no corresponden con el producto deseado y requieren la solución de problemas . Esto es más predominante en un intento de unir múltiples fragmentos , tales como en el triple ligadura . Cosas que necesitará Kit de ligación
Ligadura protocolo
gel de agarosa radio de 50 X TBA tampón ( Tris base 242 g, 57,1 ml de ácido acético glacial , 100 ml de EDTA 0,5 M diluido a 1 litro con agua )
agua desionizada
kit de purificación de ADN de
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solucionar transformación Matemáticas 1

Formular una lista de pasos a seguir en la ligadura y la transformación. Solución de problemas de cualquier protocolo científico en general, comienza con el paso final, trabajando hacia atrás .
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Comparar producto de ADN purificado de la muestra con el ADN de control, incluido en el kit . Una vez que el ADN se ha transformado y clonado en bacterias , que puede ser aislado , purificado y comprobó por electroforesis en gel de agarosa . Los resultados de la electroforesis indicarían si la transformación se ha realizado correctamente .
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Determinar el crecimiento bacteriano durante la clonación . La mayoría de los vectores bacterianos se construyen de modo que sólo aquellos con un inserto de ADN - crecerán en un medio que contiene ampicilina , u otro antibiótico . Malo crecimiento podría establecer que la muestra de ADN no se inserta correctamente en el vector .
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Confirmar que la muestra de ADN ligado se purificó , antes de la transformación . Sales tampón y enzimas de ligación podrían inhibir la transformación del ADN insertado . También es importante cerciorarse de que la enzima de ligación se inactiva por el calor , después de la finalización del procedimiento de ligadura . Ligasa activo podría potencialmente interferir con la transformación.
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Compruebe la fecha en la acción bacteriana utilizada para la transformación. Células bacterianas antiguas pierden eficacia con el tiempo. Eventualmente las células bacterianas son incapaces de transformación y clonación de calidad. Una vez que el proceso de transformación que se ha diagnosticado , puede comenzar a analizar el procedimiento de ligadura .
Solución de problemas Ligadura
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Confirme la pureza de su muestra de ADN , antes de la ligadura . Contaminantes de la sal en la muestra de ADN podrían provocar una disminución de la ligadura . La muestra de ADN debe ser purificada y libre de sales y enzimas , antes de que se utiliza en la ligadura .
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confirmar si los extremos de las hebras de ADN a ser ligados son romo o pegajosa . La ligadura se utiliza para vincular acciones distintas con extremos romos o extremos cohesivos , después de la digestión con enzimas de restricción designadas. ADN ligasa de T4 es la enzima de elección para el ADN de extremos romos - sino que también trabajará para el ADN con extremos cohesivos . Otros ligasas de ADN sólo pueden trabajar para el ADN , después de una digestión de restricción para crear extremos cohesivos . Es importante utilizar la ligasa adecuada para la prueba de ADN .
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descubre la concentración de las muestras de ADN antes de la ligación . Utilizando el ADN con alta concentración a menudo causa de ADN a ser lineal . Las instrucciones del juego proporcionarán información sobre la cantidad correcta de ADN para su uso en una reacción de ligación .
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Reemplace enzima ligasa con un nuevo lote . Las enzimas son particularmente sensibles a la temperatura ambiente y continuos ciclos de congelación -descongelación. La ligasa puede dañarse después de un número de usos , simplemente por congelación y descongelación demasiadas veces . Algunos kits recomiendan que ligasa se ​​dividió en alícuotas en porciones más pequeñas durante el uso inicial, para reducir el número de veces que es volver a congelar .
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Compruebe el kit de unión . A menudo el problema con la ligadura está utilizando un kit que ha caducado o ha sido contaminado con otro ADN y sales.