análisis de transferencia Western es una técnica bien conocida para la identificación de proteínas específicas aisladas de tejido . Las diferentes proteínas se separan primero por la carga y el peso en SDS - gel de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa . Después de la transferencia , anticuerpos marcados se unen específicamente con la proteína deseada y se fotografiaron usando una película de rayos X o visualizado por tinción específico de la proteína . El resultado final muestra bandas oscuras indican la presencia de la proteína identificada . Este artículo se centra en la metodología básica para la realización de análisis de Western blot en un laboratorio calificado para la investigación de proteínas complejas. Cosas que necesitará
gel de SDS- poliacrilamida (SDS- PAGE) con proteínas distintas
nitrocelulosa membrana
Agua destilada
Transferencia tampón ( Tris 30 g , 144 g de glicina y 200 ml de metanol en 1 l agua) papel de filtro
, Whatman 3 mm
esponja Laboratorio
cámara de transferencia de Western blot
fuente de alimentación de laboratorio
refrigerador de laboratorio
agitador Laboratorio
solución salina tamponada con Tris (TBS ) ( 24,2 g Base Tris, 80 g de NaCl en 1 l de agua)
solución de bloqueo (5 por ciento de leche desnatada en polvo en TBS)
solución de anticuerpo primario
solución de conjugado anticuerpo marcado
solución de sustrato de fosfatasa alcalina con nitro azul tinción de tetrazolio
tampón fosfato salino ( PBS) Pequeña caja Gel- imager
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Traslado Proteínas de membrana de nitrocelulosa Matemáticas 1

Preparar la membrana de nitrocelulosa . La membrana debe ser empapado en agua destilada durante dos minutos , y luego se colocó en el tampón de transferencia y se deja en remojo durante cinco minutos.
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Montar un bocadillo que consiste en la transferencia de papel de esponja /filtro /SDS PAGE /papel de la membrana de nitrocelulosa /filtro /esponja. El sándwich está alineado de modo que la membrana se encuentra más cerca del ánodo y el gel más cerca del cátodo dentro de la cámara de transferencia .
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Añadir tampón de transferencia en la cámara de manera que se sumerge el sándwich . Coloque la cámara en el interior del refrigerador de laboratorio. La transferencia de la proteína desde el gel a la membrana se debe realizar a 4 grados Celsius .
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Configuración de la fuente de alimentación para transferir proteínas desde el gel sobre la membrana . La dirección de la transferencia hacia el ánodo es indicado por el cable rojo . Las proteínas más grandes se mueven más rápidamente en respuesta a una corriente eléctrica y se moverán primero . La fuente de alimentación controla la velocidad de transferencia . Establezca el poder de 30 V y 40 mA para una transferencia durante la noche.
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Desmonte la fuente de alimentación después de la transferencia se ha completado. No haga contacto con el tampón de transferencia o eliminar el bocadillo mientras está conectada la fuente de alimentación.
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Retire la membrana desde el bocadillo y se incuba durante dos horas en solución de bloqueo . Las proteínas en la solución de bloqueo se absorben en la membrana donde no hay proteínas están presentes . Se evitará que cualquier anticuerpo de unión a la membrana , donde la proteína deseada no está presente .
La unión del anticuerpo
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Incubar la membrana de nitrocelulosa con una solución de anticuerpo primario utilizando un agitador. La membrana debe estar completamente sumergido en la solución durante al menos una hora . Es aceptable para incubar durante la noche .
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Lavar la membrana a fondo para eliminar el anticuerpo no unido . Cuatro lavados de 10 minutos separados con TBS suelen ser suficientes para eliminar el exceso de anticuerpos.
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Incubar la membrana en la solución del conjugado anticuerpo marcado con el agitador. La membrana necesita ser incubaron durante un mínimo de una hora . El conjugado de anticuerpo marcado se une a la fosfatasa alcalina . Es la mezcla de enzima-anticuerpo que reconocen y se unen al primer anticuerpo .
Detección de la proteína
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Enjuague la membrana durante 10 minutos en PBS cuatro veces . Esto eliminará el resto del conjugado anticuerpo marcado .
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Incubar la membrana en solución de sustrato de fosfatasa alcalina hasta que aparecen los patrones de bandas . El tinte en la solución de sustrato se unirá al antígeno- anticuerpo-proteína en la membrana y formar una banda de color oscuro . El proceso puede ser inmediata o requerir hasta 30 minutos antes de que se observan las bandas .
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Envuelva la membrana completamente en celofán y colocarlo directamente sobre el gel de imágenes para visualizar los resultados . El gel de imágenes es capaz de fotografiar los resultados mostrados en la membrana de transferencia de Western.