transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET ) es una técnica de ensayo utilizado para medir la presencia y la cantidad de unión entre dos proteínas indicadoras de cuenta. Este ensayo se usa comúnmente para analizar las proteínas de unión potencialmente en diversos tipos de células , y para medir la eficacia de las enzimas de tipo de conjugación . El equipo de detección necesaria depende en gran medida de los tipos de moléculas indicadoras que se utilizan , aunque muchas veces al sencillo de 96 pocillos lector de placas se pueden usar . Cosas que necesitará
Protein-of-interest/Reporter molécula construye para cada proteína está probando
bloque de placa de 96 pocillos
lector de placas de 96 pocillos
tampón de reacción (generalmente Tris o fosfato - basado en solución salina tamponada con )
Conjugación enzima (si es necesario )
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Configuración y lectura Matemáticas 1

Generar o preparar construcciones de fusión de cada una proteína de interés , con cada uno está unido a una molécula de fluorescencia de transmisión tales como la proteína verde fluorescente ( GFP ) , rodamina o de boro - dipyrromethene ( BODIPY ) .
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Determinar de absorbancia y de emisión de longitudes de onda de cada componente fluorescente y de el ensayo general . ( Por ejemplo , si el ensayo mide GFP - > transferencia de energía de fluorescencia de rodamina , la longitud de onda de absorbancia de entrada es la de la absorbancia de GFP ( 488 nm ) , y la longitud de onda de detección de emisiones es que para la rodamina ( 595 nm ) )
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Crear tampón de reacción adecuado para el experimento , en función de las proteínas de las propiedades bioquímicas de interés . Un tampón basado en TRIS se utiliza a menudo , incluyendo cloruro de calcio y 0,05 por ciento de Tween - 20 . Las concentraciones y los componentes específicos se puede determinar mediante la búsqueda de las entradas del diario que detallan las reacciones y condiciones similares .
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Mezclar las dos proteínas -reportero conjugado de interés en diversas concentraciones en el tampón de reacción , y la alícuota 50-200 ul por pocillo. Añadir una enzima de conjugación ( por ejemplo , sortase ) a cada pocillo de muestra si es apropiado. Si se realiza un ensayo de punto final , permitir la incubación a temperatura ambiente ( o la temperatura óptima de la enzima ) por un período de tiempo determinado , y luego leyó en un lector de placas de 96 pocillos. Si se realiza un ensayo de cinética , proceder directamente a la lectura ( ver abajo). Placa
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Insertar la muestra en un lector de placas de 96 pocillos. Crear una nueva página de prueba y acceder al menú de configuración. Introduzca el valor corregido (excitación ) y longitudes de onda de emisión , a continuación, seleccione los pocillos adecuados para ser leídos .

Si se realiza un experimento de cinética , ajuste el tiempo de curso del experimento y el período de intervalo de lecturas (como una vez cada 10 minutos) .

comenzar a leer la muestra.

Analizar datos usando gráficos de funciones de Microsoft Excel (u otro programa de graficación como GraphPad ) .