Un ELISA o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas , es una técnica de laboratorio bioquímico realizado para detectar un antígeno (como una proteína) o anticuerpo en una muestra experimental . El ensayo se aprovecha de unión del anticuerpo - antígeno y se puede utilizar para ensayo de otros mecanismos celulares y moleculares de unión también. En un ensayo de ELISA a base de proteínas , un " capturar " anticuerpo o proteína se establecerán en un plato de ensayo y se permite que se adhieran al plato , después de lo cual la " sonda " agente (como proteínas de uno de los intereses) se establece y se incubó con el agente de captura . Después de varios lavados , una " detección " anticuerpo se añade con el fin de visualizar la presencia o ausencia de anticuerpo - antígeno o proteína - proteína de unión . Cosas que necesitará
plato de ensayo (por ejemplo, el bloque de 96 pocillos)
captura de anticuerpos (diluido a 5 ug /ml en mM NaHCO2 50 , pH 9,6 )
sonda anticuerpo /proteína ( diluyeron a varios concentraciones )
anticuerpo de detección ( por ejemplo , rábano anticuerpo acoplado a peroxidasa )
tampón PT ( PBS 1x , 0,05 por ciento de Tween - 20 )
tampón de bloqueo ( 1x PBS con 5 mg /ml de BSA , o 5 por ciento leche descremada en 1x PBS)
reactivo de detección (es decir, mezcla de reactivo TMB)
agitador de laboratorio mecánico
habitación fría o en el refrigerador
pipeta y puntas de
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1

Diluir anticuerpo de captura a 5 ug /ml en 50 mM NaHCO2 (pH 9,6 ) . Agregar 50 uL a cada pocillo de la placa de la muestra utilizada para la prueba. Cubrir con plástico o aluminio y se incuba durante la noche a 4 grados C en un agitador .
2

de vaciado a cabo anticuerpo de captura y lavar dos veces con 200 uL de tampón PT . Añadir 200 l de tampón de bloqueo por pocillo ( PB o 5 por ciento de leche descremada) . Incubar en cualquier lugar desde dos horas a toda la noche con agitación a 4 grados C.
3

Vacíe el amortiguador de bloqueo y lavar 4 veces con 200 uL de tampón TE. Añadir " sonda " muestras de proteínas a diversas concentraciones en PB o 5 por ciento de leche desnatada , la adición de 100 l por pocillo . Incubar una hora de agitación a 4 grados C. Vacíe soluciones sonda y lavar seis veces con 200 uL de tampón TE.
4

Añadir anticuerpo de detección (anticuerpo conjugado con HRP ) diluido 1:4000 en tampón PB o leche descremada en un 5 por ciento (ya sea una que contiene 0,05 por ciento de Tween- 20 ) , la adición de 50 l por pocillo de muestra. Incubar durante 30 minutos a una hora de agitación a 4 grados C.
5

Vuelca solución de anticuerpos de detección y lava 6 veces con 200 uL de tampón PT por pocillo , seguido de lavado dos veces con 200 l de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato) . Vacíe PBS y añadir 100 l de reactivo de detección por pozo ( para HRP , utilizar el reactivo recién mezclado TMB mezclando sustrato TMB y peróxido a 01:01 ) . Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, agitando de vez en cuando .

Cuando se utiliza TMB y HRP : por último, añadir 100 l de 1M H3PO4 (ácido fosfórico ) por pocillo para detener la reacción TBM

Leer placa con lector de análisis de la muestra , como un lector de placas de 96 pocillos. . (Para HRP y TMB , utilice la plantilla " ELISA de punto final del ensayo ", disponible en la mayoría de los lectores. )