Pruebas de ácidos nucleicos se lleva a cabo en el diagnóstico médico con el fin de detectar los patógenos , como virus o bacterias. Estas pruebas son mucho más rápida y , por lo tanto , permiten a un médico para iniciar el tratamiento de un paciente que normalmente habría tenido que esperar la confirmación de la infección mediante ensayos basados ​​en anticuerpos más largas y tediosas . El proceso también se conoce como una prueba de amplificación de ácido nucleico , e incluye un método conocido como " amplificación por transcriptasa inversa " por reacción en cadena de la polimerasa . Dado que este es un procedimiento científico altamente especializado , conocimientos avanzados y experiencia en técnicas de biología molecular y se necesita teoría. Cosas que necesitará
tubos PCR
PCR cicladora
Pipetas y puntas con filtro
Guantes
células
Trizol u otro reactivo de extracción de RNA
PCR buffer
Taq polimerasa
RT-PCR a una concentración de 1 mg /ml
agua libre de RNasa
dNTPs MgCl2

Random primers a 1,8 mg /ml de concentración
superíndice II transcriptasa inversa

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células de la cosecha con un reactivo de extracción de ARN , como Trizol
transformación y preparación de ARN. 1 ml , es suficiente para recoger las células de un pocillo de una placa de cultivo tisular de seis pocillos . Las células se pipetearon cuidadosamente hacia arriba y abajo para homogeneizar y luego llevar a cabo el procedimiento de extracción como se describe en la hoja de Trizol . Brevemente , se extrae con cloroformo , después centrifugar para separar las fases de ADN , proteínas y ARN . Recuperar sólo la fase de ARN incoloro y precipitar con isopropanol que . Después de la incubación , las centrífugas que y limpiar el sedimento resultante con varios lavados con etanol . Entonces resuspender el precipitado en agua libre de RNasa .
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Para la transcripción reversa, desnaturalizar exactamente 5 microgramos de ARN a 65 grados Celsius en un 10 microlitros ( ul ) volumen de agua libre de RNasa , y rápidamente colocar en hielo . Para cada reacción , se combinan 10 ul de ARN , 3 ul de tampón de reacción PCR 10X , 2,5 ul de dNTP 10 milimolar , 6 l de 25 milimolar de cloruro de magnesio , 1 ul de cebadores aleatorios de 1,8 miligramo por mililitro de concentración , y 0,5 ul de superíndice II enzima de transcriptasa inversa . Rellenar cada reacción con 17 ul de RNasa libre de agua . Incubar los tubos a temperatura ambiente durante diez minutos y después a 42 grados Celsius durante una hora para producir el ADNc , a continuación, desnaturalizar a 95 grados Celsius y hielo rápidamente para detener la reacción .
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Para una reacción en cadena de la polimerasa , de nuevo establecer una mezcla de reacción en tubos de 0,5 ml mediante la combinación de 6 ul de ADNc obtenido en la reacción de transcripción inversa , 1,5 ul de tampón de reacción PCR 10X , 0,2 microlitros de la Taq polimerasa , 0,5 microlitro de cebador inverso y también de cebador directo , entonces recargar cada tubo con 10,3 l de RNasa libre de agua . Para ejecutar las reacciones , establecer un ciclador térmico ( es decir, una máquina que lleva a cabo reacciones en cadena de la polimerasa ) para 30 ciclos como sigue : 95 grados Celsius durante 0,5 minutos para desnaturalizar , seguido por 60 grados centígrados durante 45 segundos a recocido , y finalmente 72 grados Celsius durante 1 minuto para extender la transcripción sintetizada.