Glutathione o GSH es un tripéptido no esenciales a partir de cisteína, glutamato y glicina. Es un poderoso antioxidante que protege las células y órganos del cuerpo de los efectos nocivos de los ROS, o especies reactivas de oxígeno, que se forman a partir de oxígeno molecular como resultado de diversos procesos metabólicos en el cuerpo. Los antioxidantes, como el glutatión, neutralizar los ROS y les impiden interactuar y dañar el ADN y las proteínas en las células. La relación de la forma oxidada y reducida de GSH en el cuerpo es un indicador del estrés oxidativo ROS relacionados en su cuerpo. Cosas que necesitará
Jeringa
mariposa aguja
centrífuga
heparina sódica
Congelador
ácido sulfosalicílico
GSH Reacción Agente
microplacas
Fuente de luz
solución estándar de GSH
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1

Dibujo por aproximadamente 2 ml de sangre por punción en la vena anticubetal con una aguja de mariposa de calibre 23 unida a una jeringa de 5 ml. Añadir la muestra a tubos de ensayo que contienen heparina sódica y se invierte suavemente el tubo para mezclar.
2

Recoger las células rojas de la sangre mediante la centrifugación de la muestra a 2500 revoluciones por minuto durante cinco minutos. Congelar y descongelar la muestra tres veces para romper las células. Centrifugar la solución de lisado celular durante 10 minutos a 12.000 rpm y 4 grados, y se recoge el sobrenadante.
3

Retire la proteína de la muestra mediante la adición de ácido sulfosalicílico 5 por ciento y centrifugando la muestra a 12.000 rpm durante cinco minutos a 4 grados. Guardar el sobrenadante desproteinizado a -112 grados.
4

Mezclar un agente de detección tiol, GSH reductasa, la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato y tampón de ensayo en las proporciones indicadas por el fabricante del equipo para hacer la mezcla de reacción GSH. La cantidad de cada sustancia química depende de la cantidad de pruebas de que la intención de llevar a cabo. Se diluye la mezcla de reacción GSH en ácido sulfosalicílico 5 por ciento para obtener concentraciones de 16, 32, 63, 125, 250 y 500 microlitros.
5

Añadir 1 a 10 microlitros de la muestra de sangre desproteinizado en los pozos de una microplaca. Añadir diluido en serie solución estándar de GSH, que está disponible en el kit de prueba, a cada pocillo para llevar el volumen total de cada pocillo a 10 microlitros.
6

Añadir 90 microlitros de mezcla de reacción de GSH que realizó en el paso 4 para cada pocillo de la microplaca. Mezclar el reactivo agitando la placa durante 30 segundos.
7

Medir la absorbancia inmediatamente colocando la placa a la luz con longitudes de onda de 405 y 415 nanómetros. Incubar la placa durante 30 minutos. Tome lecturas de absorbancia después de cada cinco minutos durante la incubación.
8

Diluir 6 milimolar de la muestra procesada con 5 por ciento de ácido sulfosalicílico y solución de sulfonato trifluromethane. Esto eliminará toda la GSH reducido de la solución. Añadir 1 a 10 micoliters de esta solución a los pocillos de la microplaca y repita los pasos 5, 6 y 7. Esto le ayudará a calcular la cantidad de GSH oxidado en la muestra.
9

Trace la absorbancia y la concentración de la muestra en un gráfico para obtener la curva de GSH tanto glutatión reducido y oxidado. Calcular la relación entre ambas formas de GSH. El aumento de los niveles de los niveles de GSH oxidación indican estrés oxidativo y ROS.