Métodos para la Medición de la NADPH-Oxidase
NADPH oxidasa pertenece a una familia de enzimas que ayudan en la transferencia de electrones entre NADPH y oxígeno. Sin embargo, la NADPH oxidasa tiene la capacidad única de producir especies de oxígeno reactivas a partir de esta reacción, en comparación con otros miembros de la familia donde las especies de oxígeno reactivo se genera a través de otros medios. Un complejo de la proteína multimérica, la NADPH oxidasa se compone de la flavocitocromo b558 unido a la membrana, que se utiliza como un marcador de medición.
Especies reactivas de oxígeno (ROS) Generación
Como la principal fuente de ROS, en particular peróxido de hidrógeno, la NADPH oxidasa produce cantidades pequeñas pero consistentes a través de su isoforma expresada en los vasos sanguíneos, que están involucrados en los procesos de señalización. Esta producción constante puede llegar a saturar el sistema antioxidante natural, causando una pérdida de compuestos protectores como el óxido nítrico, y la generación de ROS aún más potente.
Quimioluminiscencia Método
quimioluminiscencia permite altamente sensible, la medición automatizada de la actividad de la NADPH oxidasa en un rango de concentraciones. Durante este método, se añade el sustrato NADPH a una muestra de tejido que contiene la NADPH oxidasa. Tras la reacción, se genera ROS y reacciona con el compuesto lucigenina para producir un efecto quimioluminiscentes, que se mide. La luminiscencia es directamente proporcional a la actividad NADPH oxidasa, la enzima que determina la velocidad de la reacción.
Ensayo cinético mediante citometría de flujo
En este método, se analizaron muestras de tejido mediante citometría de flujo. La médula ósea se separa de la muestra usando solución salina equilibrada de Hanks. Manchas específicas y anticuerpos de detección se añaden a la muestra en tubos de poliestireno. La muestra se incubó a continuación, se lavó con solución salina equilibrada de Hanks, marcado con sondas moleculares y preparó a partir de citometría de flujo. Los tubos de control también se realizan para la comparación y para calibrar el citómetro de flujo. La máquina se corrió y mediciones registradas.