NAD y NADH son dos nucleótidos de piridina implicados en el metabolismo. NADH y NAD se encuentran co-enzimas en las mitocondrias, las centrales eléctricas de la célula. Tanto NAD y NADH están involucrados en las reacciones celulares, tales como la respiración y la fotosíntesis donde se generan la energía e hidrógeno. NAD y NADH combustible reacciones bioquímicas que requieren una serie de enzimas para producir ATP, la principal fuente de energía en las células. Cosas que necesitará
células o tejidos bajo estudio
NADH ensayo kit
buffer fosfato salino
Dry Ice
Calefacción bloque
96 pocillos
centrífuga
Etiquetada tubos
Placa lector
Vortex
concentración conocida de NADH
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Ensayo
1

Lavar las células o tejidos bajo estudio con fosfato fría -solución salina tamponada, PBS. Extraer las células o romper el tejido en tampón de extracción mediante la colocación de la mezcla en hielo seco durante 20 minutos y luego a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita.
2

Vortex durante 10 segundos. Girar en una centrífuga durante 5 minutos a pellet de células o restos de tejido. Eliminar el sobrenadante, la fase líquida, y colocar el líquido en un tubo limpio.
3

sobrenadante filtra a través de un filtro especial para eliminar las enzimas que se NADH avería.
4

Eliminar 200 microlitros, colocar en un tubo limpio y se calienta a 60 grados centígrados en un bloque de calentamiento durante 30 minutos para desnaturalizar NAD. Enfriar y centrifugar y eliminar la fase líquida. Transferir 50 microlitros en una placa de 96 pocillos, cada muestra debe ser por duplicado o triplicado. Para determinar NAD total NADT, no hace calor.
5

Preparar y poner la mezcla en bicicleta a la placa de 96 pocillos. Mezclar e incubar durante 5 minutos. Añadir 10 microlitros de desarrollador y dejar incubar a temperatura ambiente durante un máximo de 4 horas. Añadir la solución de parada. Leer cambio de color en un lector de placas o fluorímetro dependiendo kit.
Curva estándar y Cálculo
6

Preparar una curva patrón, a una concentración conocida de NADH y diluyéndolo en tampón de extracción. Diluir en diferentes concentraciones, que garantiza que el volumen final sigue siendo el mismo que las muestras de ensayo. Placa en la misma placa de 96 pocillos como muestras de ensayo. Leer la densidad óptica.
7

Dibujar gráfico de la curva estándar con la concentración en el eje X y la densidad óptica en el eje Y. Tome un promedio de cada muestra de prueba y lea la concentración de la gráfica de la curva estándar.
8

Calcular la relación NAD /NADH restando NAD total NADT, desde el NADH y luego dividiendo por NADH.