Pruebas de ácidos nucleicos se lleva a cabo en el diagnóstico médico con el fin de detectar patógenos, tales como virus o bacterias. Estas pruebas son mucho más rápida y, por lo tanto, permiten a un médico para iniciar el tratamiento de un paciente que normalmente habría tenido que esperar la confirmación de la infección por el uso de más largo y tedioso ensayos basados ​​en anticuerpos. El proceso también se conoce como una prueba de amplificación de ácido nucleico, e incluye un método conocido como "amplificación de la transcriptasa inversa" por reacción en cadena de la polimerasa. Dado que este es un procedimiento científico altamente especializado, conocimientos avanzados y experiencia en técnicas de biología molecular y la teoría que se necesita. Cosas que necesitará
PCR tubos
termociclador PCR
pipetas y puntas con filtro
Guantes
células
Trizol u otra extracción de RNA reactivo
PCR tampón Taq polimerasa

RT-PCR primers a 1 mg /ml de concentración
RNasa libre de agua | dNTPs MgCl2

Random primers a 1,8 mg /ml de concentración
superíndice II transcriptasa inversa

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procesamiento y preparación de ARN
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células de la cosecha con un reactivo de extracción de ARN, como Trizol. 1 ml, es suficiente para recoger las células de un pocillo de una placa de cultivo tisular de seis pocillos. Las células se pipetearon cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar y luego llevar a cabo el procedimiento de extracción como se describe en la hoja de Trizol. Brevemente, se extrae con cloroformo, a continuación, centrifugar para separar las fases de ADN, proteínas y ARN. Recuperar sólo la fase de ARN precipitado incoloro y que con isopropanol. Después de la incubación, que centrifugadoras y limpiar el sedimento resultante con varios lavados de etanol. A continuación, volver a suspender el sedimento en agua libre de RNasa.
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Para la transcripción reversa, desnaturalizar exactamente 5 microgramos de RNA a 65 grados centígrados en un microlitro (ul) volumen de agua libre de RNasa 10, inmediatamente después, lugar en el hielo. Para cada reacción, se combinan 10 ul de ARN, 3 ul de tampón de reacción 10X PCR, 2,5 ul de 10 milimolar de dNTP, 6 l de cloruro de magnesio 25 milimolar, 1 ul de cebadores aleatorios de 1,8 miligramos por mililitro de concentración, y 0,5 ul de superíndice II enzima transcriptasa inversa. Rellenar cada reacción con 17 ul de RNasa libre de agua. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante diez minutos y después a 42 grados Celsius durante una hora para producir el ADNc, a continuación, se desnaturalizan a 95 grados Celsius y rápidamente el hielo para detener la reacción.
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Para una reacción en cadena de la polimerasa, de nuevo establecer una mezcla de reacción en tubos de 0,5 ml mediante la combinación de 6 l de ADNc obtenido en la reacción de transcripción inversa, 1,5 ul de tampón 10X de reacción de PCR, 0,2 microlitros de la Taq polimerasa, 0,5 microlitro de cebador inverso y también del cebador, luego rellenar cada tubo con 10,3 l de RNasa libre de agua. Para ejecutar las reacciones, establecer un termociclador (es decir, una máquina que lleva a cabo una reacción en cadena de polimerasa) durante 30 ciclos de la siguiente manera: 95 grados Celsius durante 0,5 minutos para desnaturalizar, seguido de 60 grados centígrados durante 45 segundos para templar y, finalmente, 72 grados Celsius durante 1 minuto para extender la transcripción sintetizada.