protocolos de clonación molecular abarcan los procedimientos utilizados para definir, aislar y replicar una secuencia de ADN. Restricción tradicional y protocolos de clonación de ligación inician la fragmentación del ADN con endonucleasas de restricción (enzimas que cortan las hebras de ADN en sitios de restricción), la ligadura fragmento de ADN (la reparación de discontinuidades en moléculas de ADN), transfección (la introducción de ácido nucleico en un cuerpo de la célula) y la selección (la elección de los genomas individuales para la replicación). Aislamiento

protocolos para el aislamiento de un fragmento de ADN, el primer paso en la clonación molecular, a menudo incorporan una reacción en cadena de la polimerasa (PMR), que utiliza ciclos de calentamiento y enfriamiento para amplificar fragmentos de ADN. Para alcanzar el objetivo secuencia de tamaño, otros protocolos incluyen sonicación ADN, digestión con enzimas de reacción y el uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. Estos protocolos varían en función de la magnitud y la cantidad de ADN aislado es necesario.
Ligadura
Protocolos

para ligadura implicar el uso de una enzima, la ADN ligasa, para unirse a las moléculas de ADN, junto con un enlace covalente. Protocolo dicta que combina fragmentos de ADN, el vector de clonación, un tampón de ligación, el DNA ligasa y agua esterilizada en un tubo de microcentrífuga y se incubó durante la noche a 4 grados Celsius.
Transfección

Protocolos

para la transfección, ADN o infusión en una célula utilizando un medio no-virales, a menudo implican la inyección de ADN directamente en el citoplasma de la célula. Otros métodos incluyen el uso de reactivos químicos, tales como el fosfato de calcio y lípidos, para entregar el complejo de transfección a través de la membrana celular. Este método pone a prueba los efectos de la modificación genética en el funcionamiento de los genes específicos.
Selección
Selección

, o evaluación, protocolos determinan que las células se celebró con éxito la inserción de ADN e indican que las células necesitan aislamiento. A las células cosechas de centrífuga que contienen el ADN transfectado, que luego se incubó en una lisozima (una enzima natural) tampón y se trató con un detergente alcalino, dando las proteínas y las membranas de solubilidad. El uso de etilo para precipitar las proteínas, una centrífuga y filtro estopilla el ADN que contiene sobrenadante (líquido soluble que queda de un compuesto de centrifugado). El sobrenadante se precipitó con polietilenglicol, se centrifugó, y se suspendió en un tampón de cloruro de cesio y bromuro de etidio. Las manchas de bromuro de etidio del ADN de acuerdo con la densidad, y el uso de una luz UV de onda larga, el ADN inferior-banda se extrae con una jeringa de cinco cc. Una columna de intercambio iónico equilibrada separa el ADN a partir del bromuro de etidio y cloruro de cesio, y el último sedimento de ADN se suspende en una solución tampón y se detecta en la electroforesis en gel de agarosa.