Protocolo ELISA basado en células

ELISA o prueba de inmunoensayo ligado a enzimas , se utiliza como herramienta de diagnóstico en la medicina y en la investigación biológica para cuantificar la cantidad de una proteína específica . ELISA utiliza anticuerpos para detectar la proteína de interés y un reactivo que produce un color . La cantidad de color se refiere a la cantidad de proteína . Cultivo Celular

Las células deben ser colocados en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de medios de cultivo y las células se deja reposar durante la noche. Si usted está estudiando la reacción de las células de un factor , las células deben ser privadas de suero durante 24 horas y luego se estimularon con el factor en estudio.
Fijación y Anticuerpo Primario

Después de la retirada de los medios de comunicación , las células son tratadas con un fijador tal como 3 por ciento de formaldehído , o metanol . La membrana de la célula necesita ser permeabilizadas para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula . La permeabilización se puede lograr mediante el uso de 0,1 por ciento de Triton , si metanol no se ha utilizado previamente . La unión no específica se pueden prevenir con el uso de un 10 por ciento de suero de ternera fetal diluida en solución salina tamponada con fosfato. Después de retirar el bloque , el anticuerpo primario se puede aplicar y se incubó durante una hora.
Anticuerpo secundario y Stain

Eliminar el anticuerpo primario , y el lavado tres veces . Añadir un anticuerpo secundario unido a un agente de detección , tal como peroxidasa de rábano picante . Incubar durante una hora . Washington Añadir la solución de sustrato quimioluminiscente. Desarrollar y escanear la placa de la intensidad del color .