Cómo medir la viabilidad celular

En la mayoría de los experimentos biológicos que implican el cultivo de células , un paso crítico incluye saber qué células están vivas y que están muertos en su muestra. Exclusión de colorante es el método más popular de la medición de la viabilidad celular . Exclusión de colorante se basa en la teoría de que las células vivas contienen membranas intactas y células muertas no lo hacen, por lo tanto las células muertas absorben el colorante en el citoplasma . Hay diferentes tintes y los protocolos y los métodos que usted elija debe basarse en el precio , la sensibilidad , la facilidad y la duración del procedimiento. El azul tripán es un colorante común usado para medir la viabilidad celular debido a que el procedimiento se puede realizar en cinco a 10 minutos y cuesta sólo la cantidad del reactivo de colorante . Cosas que necesitará
reactivo azul tripano al 0,4%
Hemocitómetro
cubreobjetos
micropipeta
Puntas de pipeta
tampón fosfato salino ( PBS)
microscopio de luz

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obtener un pellet de las células que se está midiendo .
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Resuspender el sedimento celular en PBS para obtener aproximadamente 5 x 105 células /ml . PBS se utiliza porque las mediciones de viabilidad son más precisos cuando las células están en un ambiente libre de suero; proteínas séricas también pueden manchar y le dará resultados erróneos.
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Añadir a partes iguales de la suspensión de células en PBS a partes iguales de 0.4 % de tripano colorante azul para obtener un 1-2 dilución ( ejemplo : . 100 ul de células a 100 ul de azul de tripano ) y mezclar pipeteando arriba y abajo
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Incubar la mezcla durante menos de tres minutos a temperatura ambiente . Si las células se cuentan después de aproximadamente cinco minutos , la viabilidad será inexacta debido a la muerte celular .
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Con la hoja de la cubierta ya en su lugar , llenar cada lado de un contador de hemocitómetro con la suspensión de células . Por lo general , cada parte tendrá 10 a 20 ul.
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Coloque el hemocitómetro en el escenario de un microscopio de luz y se centran en las células .
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Cada lado de el hemocitómetro contiene varias plazas. Cuente el número total de células en una plaza del hemocitómetro . Luego, cuente el número de no viables ( azul) y de células viables (borrar) por separado , en la misma plaza .
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Calcular el porcentaje de células viables en la plaza de dividir el número de células viables por el número de células totales y multiplicando por 100 . Haga esto por varios casillas del hemocitómetro para obtener una medición promedio viabilidad.