QuikChange mutagénesis Protocolos

QuikChange mutagénesis es el nombre comercial de un kit utilizado en la investigación biotecnológica para inducir la mutación genética o la alteración del ADN. Agilent Technologies es la empresa responsable del producto , que está disponible en dos versiones, QuikChange II y QuikChange Rayo. Ambos kits contienen una solución tampón , la enzima ADN polimerasa , reactivos de color , secuencias de ADN o cebadores , y muestras de células . Protocolo de reacción Mutant Strand Síntesis

Técnicos sintetizan dos oligonucleótidos o secuencias cortas de ADN que contienen la mutación deseada. A continuación, se preparan la reacción de control con las secuencias de ADN , solución mezcla de dNTP y la enzima ADN polimerasa , la adición de agua destilada . Más tarde , se preparan una serie de reacciones de ejemplo utilizando diversas concentraciones de ADN de doble cadena ( dsDNA ) , mientras se mantiene el cebador o la concentración de oligonucleótidos constante , de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Se mantienen las muestras a 203 grados F por 30 segundos. La muestra que contiene segmentos de ADN número dos también se ha probado bajo ciclos de temperatura , una técnica donde los cambios de temperatura durante períodos cortos de tiempo. Finalmente , las muestras se colocaron en hielo durante dos minutos .
Dpn I digestión del protocolo de amplificación Productos

enzima de restricción Dpn I corta el ADN en sitios específicos . Una micro - litros de esta enzima se añade directamente a cada reacción de amplificación por debajo de su norma capa de aceite mineral utilizando una micro- pipeta o punta de pipeta especializada resistentes a los aerosoles . Sin embargo, una capa de aceite mineral sólo es necesario si el termociclador , un aparato utilizado para amplificar segmentos de ADN , no tiene un montaje superior caliente . La reacción es mezcló suavemente y se puso después en un micro - centrífuga durante un minuto . Después de eso , las muestras se incubaron a 98,6 grados F durante una hora.
Transformación de células XL1 -Blue supercompetentes Protocolo

XL1 -Blue es una tetraciclina resistentes línea celular que viene con el kit QuikChange mutagénesis . Durante este protocolo , los técnicos se descongelan las células , que se mantuvieron con anterioridad a -112 grados F , en hielo. Luego añadir una micro - litros del ADN tratado con Dpn I , es necesario calentarlo a 107,6 grados F durante 45 segundos y colocan la reacción en hielo durante dos minutos. Después de este procedimiento , los técnicos añaden una preparación de NZY ( hidrolizado de caseína y extracto de levadura ) precalentado a 107.6 grados F y se incuban durante una hora. La preparación se pone entonces en placas de gel de agar y se incubaron a 98,6 grados F durante 16 horas.