Métodos de medición de la NADPH - oxidasa
NADPH oxidasa pertenece a una familia de enzimas que ayudan con la transferencia de electrones entre NADPH y oxígeno . Sin embargo , la NADPH oxidasa tiene la capacidad única de producir especies de oxígeno reactivas a partir de esta reacción , en comparación con otros miembros de la familia donde las especies de oxígeno reactivo se genera a través de otros medios . Un complejo de la proteína multimérica , la NADPH oxidasa se compone de la b558 flavocitocromo unido a la membrana , que se utiliza como un marcador de medición .
Especies reactivas de oxígeno ( ROS ) Generación
Como la principal fuente de ROS , en particular peróxido de hidrógeno , la NADPH oxidasa produce pequeñas pero consistentes cantidades a través de su isoforma expresada en los vasos sanguíneos , que están involucrados en los procesos de señalización . Esta producción constante puede llegar a saturar el sistema antioxidante natural, causando una pérdida de compuestos protectores como el óxido nítrico , y la generación de ROS aún más potente .
Quimioluminiscencia Método
quimioluminiscencia permite la medición altamente sensible y automatizado de la actividad oxidasa NADPH en un rango de concentraciones . Durante este método , se añade el sustrato de NADPH a una muestra de tejido que contiene la NADPH oxidasa . Tras la reacción , ROS se genera y reacciona con el lucigenina compuesto para producir un efecto quimioluminiscentes , que se mide . La luminiscencia es directamente proporcional a la actividad de la NADPH oxidasa , como la enzima determina la velocidad de la reacción .
Kinetic Ensayo mediante citometría de flujo
En este método, se analizan muestras de tejido a través de citometría de flujo . La médula ósea se separa de la muestra usando solución salina equilibrada de Hanks . Manchas específicas y anticuerpos de detección se añaden a la muestra en tubos de poliestireno . La muestra se incubó a continuación , se lavó con solución salina equilibrada de Hanks , marcado con sondas moleculares y preparó a partir de citometría de flujo . Los tubos de control también se realizan para la comparación y para calibrar el citómetro de flujo . La máquina está entonces corrió y mediciones registradas .