Procedimientos de crioconservación
Resumen
procedimientos de crioconservación son las que permiten que las células pueden almacenar indefinidamente mediante el uso de temperaturas extremadamente frías a suspender las actividades metabólicas . Hay dos tipos principales de procedimientos de criopreservación : equilibrio ( congelación lenta convencional ) y no-equilibrio o la congelación ultra- rápida ( vitrificación ) . El término vitrificación viene del latín " vítreo " o vítreo. Ambos procedimientos utilizan crioprotectores con propiedades de tipo de anticongelante para prevenir el daño celular durante el proceso de congelación . Una vez que las células se congelan o vitrificados , que se pueden almacenar indefinidamente por inmersión en nitrógeno líquido , un fluido extremadamente frío con una temperatura de -196 C ( -321 F ) . Para restaurar la actividad metabólica en la célula después de la descongelación , crioprotectores tóxicos deben ser removidos de la célula y el equilibrio normal de agua restaurado gradualmente a medida que la celda se devuelve a una temperatura normal de funcionamiento .
De la célula - factores específicos
el procedimiento utilizado para criopreservar células o tejidos depende de un número de factores incluyendo el tamaño de la célula , la cantidad de fluido celular ( citoplasma ) y la complejidad de la célula ( célula única o tejido ) . Las células con una gran cantidad de citoplasma , tales como huevos son más difíciles de criopreservar que las células con sólo residual de citoplasma , como las células de esperma . La criopreservación de tejido ovárico es más difícil porque por lo menos tres tipos diferentes de células de diferentes tamaños están presentes en el tejido de ovario , cada uno con diferentes necesidades de congelación óptimas . Protocolos lenta del punto de congelación se han usado con éxito con varios tipos de células . Vitrificación actualmente es más efectivo con la congelación de una sola célula y menos eficaz con los tejidos , pero la investigación está en curso para optimizar la vitrificación de los tejidos.
Papel de crioprotectores
El citoplasma de una celda contiene agua, que se convierte en cristales de hielo a temperatura de congelación. Si se forma hielo en el interior de una célula , la célula se tritura y se muere. Por lo tanto , el fluido en la celda debe ser eliminado antes de alcanzar temperaturas de congelación para evitar el daño celular . Varios tipos de fluidos anticongelantes ( crioprotectores ) se pueden utilizar para deshidratar la célula antes de la congelación , incluyendo glicerol , propanodiol , sulfoxde de dimetilo ( DMSO ) , etanol y azúcares como la sacarosa y la trehalosa . La tasa óptima de enfriamiento ( y descongelación ) depende del tipo de crioprotector utilizado y de la característica de la célula o tejido a ser ( o que era ) congelado . Los crioprotectores son tóxicos para el metabolismo de las células para la exposición de células a crioprotectores a temperaturas más cálidas metabólicas deben minimizarse o evitarse . Al descongelar o calentar las células , crioprotectores deben retirarse completamente de la celda antes de que se restablezca la actividad metabólica.
Equilibrium Versus no equilibrio Criopreservación Procedimiento
La velocidad de congelación depende de si el protocolo de congelación de equilibrio es - o no basado en equilbrium - . Para los procedimientos de tipo de equilibrio , se consigue la tasa de congelación óptima cuando hay un equilibrio entre la velocidad a la que la célula se está deshidratado de agua y la velocidad a la cual el agua fuera de la célula se transforma a la fase de hielo . Estos protocolos de equilibrio o de lento congelación suelen tardar horas en completarse y un ordenador se utiliza para ejecutar un congelador de velocidad programable para asegurar que las tasas de congelación son exactamente como se requiere . Normalmente hay una "mano" paso en el protocolo cerca del inicio para permitir la creación manual de los cristales de hielo de arranque o " siembra " en el líquido fuera de las células , se utiliza .
En vitrificación un enfoque totalmente diferente a la congelación que no se basa en las rampas y la consecución de un equilibrio entre la deshidratación y la formación de cristales de hielo . La vitrificación es tan ultra- rápido que no hay tiempo suficiente para la formación de hielo y el líquido celular se convierte directamente en una fase vítrea o de vidrio , sin daño a la célula . Congeladores de tasa programables no son necesarios porque la célula se sumerge directamente en nitrógeno líquido muy frío , el logro de un estado vítreo instantánea .
Lenta - Freeze Procedimiento
El primer paso de el procedimiento lento - congelación es exponer la célula a crioprotector en una manera escalonada gradual para permitir lentamente de equilibrado de la célula con el crioprotector mientras que la liberación de agua . Una vez que las células han sido limpiadas de la mayoría de agua celular , las células en el líquido crioprotector se colocan en un recipiente de algún tipo , tal como una pajita de plástico , una ampolla de vidrio o un volumen vial.The plástico de líquido que rodea las células para congelación lenta es típicamente menos de una cucharadita y sólo puede ser unas pocas gotas . El recipiente de pre - marcado se llena , se sella y puso en un congelador programable , lo que disminuye lentamente la temperatura del recipiente durante un periodo de minutos u horas a temperaturas muy bajas . Después de unos minutos de enfriamiento , se deben formar cristales de hielo dentro del contenedor de arranque por " siembra " el recipiente . La siembra se realiza mediante el uso de una herramienta (por ejemplo , fórceps ) que han sido previamente enfriado en nitrógeno líquido a tocar el contenedor y causar la formación de cristales de hielo . Este cristal de arranque iniciará la formación de cristales de hielo controlada en un solo lugar , con seguridad fuera de las células . Una vez que la siembra se completa , el resto de las rampas de refrigeración puede proceder. Cuando el contenedor llega a temperaturas entre -30 y -85 C, el recipiente que contiene las células puede ser sumergida directamente en nitrógeno líquido para completar el enfriamiento a -196 C.
vitrificación
procedimientos de no equilibrio refrigeración ultra-rápido
tales como la vitrificación utilizan mayores concentraciones de crioprotectores , junto con una tasa de congelación casi instantáneo alcanzado por el desplome de las células directamente en nitrógeno líquido . La vitrificación no pasa por la fase de formación de cristales de hielo y se mueve el agua directamente a una fase similar al vidrio . Vitrificación logra el mismo punto final como la congelación lenta , pero a una tasa de -3000C/min , en comparación con 10C/min o más . Para la vitrificación , las células se colocan generalmente en la punta de una paja y se elimina el exceso de crioprotector , dejando lo suficiente para que la célula se adhiere al recipiente por la tensión superficial , antes de sumergirse en nitrógeno líquido . Debido a la congelación es tan rápido , la duración de la exposición a los crioprotectores es mucho menos , y concentraciones mucho más altas de los crioprotectores puede ser tolerada por la célula . El calentamiento de la célula para volver a funcionamiento metabólico normal también debe ser muy rápida . Manipulación de muestras vitrificados es mucho más exigente que las muestras lento - congelados porque incluso una breve exposición a una temperatura superior a la del nitrógeno líquido puede iniciar un proceso de calentamiento no planificada y volver a congelar , que es perjudicial para la célula .