Cómo detectar NADH

La nicotinamida adenina dinuceltoide (NADH ) , abreviado " NAD " , es una coenzima que se encuentra en las células vivas que produce reacciones químicas en las proteínas. Las empresas farmacéuticas estudian NADH debido a su proceso de metabolismo , y sintéticamente crean para un número de propósitos . Desde NADH es microscópica , el ojo humano no puede detectar ella. Usted necesita pruebas científicas y de un kit de ensayo para detectar su presencia . Cosas que necesitará hielo seco

micro - centrífuga
tubos Eppendorf de
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Reactivo Reconstitución Matemáticas 1

Establecer el búfer de ciclismo en un contador y deje que el búfer alcance la temperatura ambiente . La temperatura ideal para el buffer es de 22 grados Celsius.
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Reconstituir el ciclismo mezcla de enzimas NAD con exactamente 220 ​​microlitros de tampón de ciclismo. Congelar la solución a temperaturas por debajo de -70 grados Celsius.
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Reconstituir el desarrollador NADH con 1,2 ml de ddH2O . Mezcle suavemente la solución hasta que se disuelva por completo . No vórtice.
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estándar Reconstituir NADH con 200 microlitros de dimetilsulfóxido puro.
Preparación de muestras
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Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato.
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Pellet 2x10 ( 5 ) celdas para cada ensayo individuales en un tubo de microcentrífuga y funcionan a 2000 rpm durante 5 minutos.
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extraer las células con 400 microlitros de tampón de extracción NAD /NADH por congelación y descongelación de las células en dos ciclos - 20 minutos en hielo seco y 10 minutos a temperatura ambiente . Vortex la células extraídas durante exactamente 10 segundos.
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Haga girar las muestras de células en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante exactamente 5 minutos.
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Transferir el NAD /células NADH en un tubo limpio.
Protocolo de ensayo
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Diluir 10 microlitros de la norma NADH con 990 microlitros de tampón de extracción de NAD /NADH. Añadir 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 microlitros de la solución diluida en una placa de 96 pocillos por duplicado para crear 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 estándar bien . Llenar el último pocillo con 50 microlitros de tampón de extracción NAD /NADH .
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de transferencia de 50 microlitros de las muestras de células extraídas en una placa de 96 pocillos por duplicado como antes .
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Preparar las muestras de células para la detección de NADH. Descomponer el NAD a partir de las muestras de células al poner 200 microlitros de las muestras de células extraídas en tubos eppendorf . Calentar los tubos a 60 grados centígrados para en un baño de agua de temperatura controlada exactamente 30 minutos. Enfriar rápidamente las muestras mediante la colocación de los tubos en hielo . Haga girar las muestras en el micro- centrífuga para eliminar precipitados . Transferencia de 50 microlitros de las muestras descompuestos en una placa de 96 pocillos por duplicado como antes.
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Mezclar la mezcla de tampón ciclismo NAD con 100 microlitros de NAD mezcla de tampón de ciclismo y 2 microlitros de enzima NAD ciclismo. Añadir 100 microlitros de esta nueva solución en cada pocillo de las normas de NADH y muestras .
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Incubar la placa a temperatura ambiente durante exactamente 5 minutos. Este proceso convierte el NAD a NADH .
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Añadir 10 microlitros de desarrollador NADH en todos los pozos . Deje que la placa para reposar a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 hora y un máximo de 4 horas.
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Leer la placa y el cálculo de la NADH.