Las enzimas de restricción son enzimas que cortan el ADN de una o dos cadenas. Cada enzima de restricción tiene una secuencia de nucleótidos específica, llamada sitio de restricción, que reconoce y corta. Las enzimas de restricción se utilizan para la secuenciación del ADN, el análisis mutacional y la clonación y amplificación del ADN. Los científicos usan enzimas de restricción para insertar genes de interés en vectores de expresión, moléculas de ADN que pueden replicarse por separado del ADN cromosómico. El vector que contiene el gen de interés se puede introducir en una cepa bacteriana para la expresión y caracterización de proteínas.

Identifique los sitios de enzimas de restricción en su vector mirando un mapa de restricción. El mapa de restricción le indicará qué enzimas cortarán su vector y dónde.

Elija una enzima de restricción que también tenga un sitio presente en el inserto de su gen, observando la secuencia de insertar. Asegúrese de que el sitio de restricción se encuentre en una posición en su inserto que esté fuera del gen de interés, de modo que no pierda ninguna parte del gen.

Asegúrese de que no haya duplicados del Sitio de restricción en cualquier lugar de su gen o vector. Esto causará múltiples cortes en su ADN y le dará datos confusos.

Intente elegir enzimas de restricción que corten con extremos pegajosos, en lugar de extremos romos. Los extremos pegajosos se producen cuando la enzima corta el ADN de doble cadena de manera escalonada, dejando un saliente de una sola hebra que facilita la unión con un inserto cortado de la manera opuesta. Los extremos romos se producen cuando el ADN de doble cadena se corta de manera suave, y son más difíciles de unir.

Elija una enzima de restricción diferente para ambos extremos de su inserto para asegurar que se inserta en el vector en la orientación adecuada y para garantizar que el vector no se vuelva a unir a sí mismo.

Intente elegir dos enzimas de restricción que funcionen bien en el mismo sistema de búfer y temperatura . Si esto no es posible, ejecute cada digestión por separado.

Sugerencia

Se han desarrollado algunos programas web para identificar rápidamente los sitios de restricción en una secuencia de ADN. Uno de estos programas es de New England BioLabs.

Cosas necesarias

Secuencia de inserción de genes

Mapa de restricción para el vector de elección

Lista de enzimas de restricción y sus sitios de corte